核酸分離提取的原則
核酸分離提取的原則
核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。真核生物的染色體DNA為雙鏈線性分子，原核生物的“染色體”、質(zhì)粒及真核細(xì)胞器DNA為雙鏈環(huán)狀分子；有些嗜菌體DNA有時(shí)為單鏈環(huán)狀分子，RNA分子在大多數(shù)生物體內(nèi)均是單鏈線性分子，不同類型的RNA分子可以具有不同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，如真核mRNA分子多數(shù)在3’端帶有poly(A)結(jié)構(gòu)，至于病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多種多樣，有雙鏈環(huán)狀、單鏈環(huán)狀、雙鏈線狀及單鏈線狀等。
95%的真核生物DNA主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，其它5%為細(xì)胞器DNA，如線粒體、葉綠體等。RNA分子則主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，約占75%，另有10%在細(xì)胞核內(nèi)，15%在細(xì)胞器中，RNA以rRNA的數(shù)量*多（80％-85%），tRNA及核內(nèi)小分子RNA占10%-15%，而mRNA分子大小不一，序列各異?？偟膩?lái)說(shuō)，DNA分子的總長(zhǎng)度一般隨著生物的進(jìn)化程度而增大，而RNA的分子量與生物進(jìn)化無(wú)明顯關(guān)系。
分離純化核酸總的原則：1.應(yīng)保證核酸**結(jié)構(gòu)的完整性；2.排除其它分子的污染。
為了保證核酸結(jié)構(gòu)與功能的研究，完整的**結(jié)構(gòu)是*基本的要求，因?yàn)檫z傳信息全部貯存在**結(jié)構(gòu)之中，核酸的**結(jié)構(gòu)還決定其**結(jié)構(gòu)的形式以及和其它生物大分子結(jié)合的方式。對(duì)于核酸的純化應(yīng)達(dá)到
以下三點(diǎn)要求：
1.核酸樣品中不存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子；
2.其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降到*低程度；
3.排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時(shí)應(yīng)去除RNA，反之亦然。
為了保證分離核酸的完整性和純度，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)注意以下事項(xiàng)：
1.盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過(guò)程，以減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞；
2.減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解，為避免過(guò)酸、過(guò)堿對(duì)核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH4-10的條件下進(jìn)行；
3.減少物理因素對(duì)核酸的降解，物理降解因素主要是機(jī)械剪切力，其次是高溫。機(jī)械剪切力包括強(qiáng)力高速的溶液振蕩、攪拌，使溶液快速地通過(guò)狹長(zhǎng)的孔道，細(xì)胞突然置于低滲液中，細(xì)胞爆炸式破裂以及DNA樣本的反復(fù)凍貯。這些操作細(xì)節(jié)在實(shí)驗(yàn)操作中應(yīng)倍加注意。機(jī)械剪切作用的主要危害對(duì)象是大分子量的線性DNA分子，如真核細(xì)胞的染色體DNA。對(duì)分子量小的環(huán)狀DNA分子，如質(zhì)粒DNA及RNA分子，威脅相對(duì)小些。高溫如長(zhǎng)時(shí)間煮沸，除水沸騰帶來(lái)的剪切力外，高溫本身對(duì)核酸分子中的有些化學(xué)鍵也有破壞作用。核酸提取過(guò)程中，一般在低溫操作，但現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)在室溫快速提取與低溫提取，獲得核酸的質(zhì)量沒(méi)有太大差異。
4.防止核酸的生物降解，細(xì)胞內(nèi)或外來(lái)的各種核酸酶消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的**結(jié)構(gòu)，其中DNA酶，需要金屬二價(jià)離子Mg2 、Ca2 的激活，使用EDTA、檸檬酸鹽螯合金屬二價(jià)離子，基本可以抑制DNA酶活性。而RNA酶不但分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿、不易失活，所以是生物降解RNA提取過(guò)程的主要危害因素。
核酸提取的主要步驟，無(wú)外乎破碎細(xì)胞，去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除鹽類，有機(jī)溶劑等雜質(zhì)，純化核酸等。核酸提取的方案，應(yīng)根據(jù)具體生物材料和待提取的核酸分子的特點(diǎn)而定，對(duì)于某特定細(xì)胞器中富集的核酸分子，事先提取該細(xì)胞器，然后提取目的核酸分子的方案，可獲得完整性和純度兩方面質(zhì)量均高的核酸分子。
